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Research

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- Bases moléculaires de l’activité biologique de polysaccharides complexes :

  • Caractérisation structurale (RMN, Spect. Masse, spect. IR, fluorescence, UV) de polysaccharides sulfatés (fucoïdane) extraits d’algues en relation avec la compréhension de leurs propriétés anti-complémentaires
  • Recherche et caractérisation de nouvelles enzymes d’origine marine (animale et bactérienne) agissant sur le polysaccharide sulfaté fucoïdane et mise en œuvre de ces enzymes comme outils d’étude structurale et fonctionnelle.

- Etude des interactions protéine-glucide (poly/oligosaccharide) :

  • Caractérisation de complexes polysaccharide-protéine par électrophorèse capillaire
  • Apport de la spectrométrie de masse couplée aux techniques séparatives dans la caractérisation structurale et thermodynamique de complexes polysaccharide-protéine
  • microscopie de fluorescence pour l’observation à l’échelle de la molécule unique de complexes polysaccharide-protéine

Outre les rôles de structure et de réserve d’énergie habituellement reconnus aux polysaccharides, on leur reconnaît depuis peu de nouvelles fonctions biologiques qui se révèlent d’une importance capitale pour le fonctionnement cellulaire. De manière générale, les polysaccharides bioactifs exercent leurs propriétés en établissant des interactions avec leurs protéines cibles pour former un complexe macromoléculaire non covalent accompagné de modifications conformationnelles.

Notre recherche porte sur la caractérisation de ces assemblages polysaccharide bioactif-protéine par de nouveaux outils analytiques. Les objectifs affichés visent à élucider et à comprendre d’une part les mécanismes dynamiques de reconnaissance et d’assemblage de ces édifices macromoléculaires, et d’autre part les implications biologiques de ces complexes macromoléculaires. Ces assemblages sont d’une grande complexité, notamment du fait de la nature polysaccharidique d’un des partenaires. Pour les étudier nous faisons appel à des techniques de spectrométrie de masse, RMN et IR mais aussi à des techniques séparatives notamment l’électrophorèse capillaire. Nous procédons au couplage de l’électrophorèse capillaire à la spectrométrie de masse (spectromètre de masse électrospray à trappe d’ions) ce qui permet d’analyser en ligne le complexe polysaccharide-protéine préalablement séparé par électrophorèse. Dans des conditions douces d’ionisation par électronébulisation, la plupart des interactions non covalentes en solution se trouvent conservées en phase gazeuse et peuvent ainsi être détectées. La formation des complexes carbohydrate-protéine est étudié par des mesures de taux d’échange hydrogène/deutérium couplées à la digestion enzymatique ce qui permet l’analyse des surfaces macromoléculaires accessibles, l’identification des séquences impliquées dans la formation du complexe (l’identification des zones de haute affinité pour les groupements sulfate des polysaccharides anioniques), et la caractérisation de possibles modifications conformationnelles. Enfin en collaboration nous menons des expériences d’observation par microscopie de fluorescence de ces assemblages protéine-polysaccharide en solution à l’échelle de la molécule unique.

Les polysaccharides étudiés sont l’héparane sulfate et le fucoïdane. L’héparane sulfate est un glycane endogène bioactif chez l’homme ; le fucoïdane est aussi un polysaccharide sulfaté mais d’origine marine et extrait d’algues brunes. Le fucoïdane présente des activités sur les systèmes biologiques mammifères qui pourraient en faire un substitut aux polysaccharides sulfatés d’origine animale utilisés en thérapeutique (héparine). Nous avons développé une stratégie chimio-enzymatique qui nous a conduit à découvrir de nouvelles activités enzymatiques (exo- et endoglycosidase, sulfoesterase) capables de modifier spécifiquement le fucoïdane, ce qui est très utile pour l’étude du polysaccharide. Ainsi des fragments de fucoïdane ont été produits par voie enzymatique et étudiés par RMN à haut champ et par spectrométrie de masse afin d’élucider la structure du polysaccharide.

Le fucoïdane compte parmi les inhibiteurs les plus puissants du système du Complément, et nous étudions les bases moléculaires à l’origine de cette activité anti-complémentaire. Le système du Complément occupe une place majeure dans les mécanismes de défense de l’organisme. Activé en début de toute agression tissulaire, le Complément constitue un mécanisme de défense précoce au cours de la réaction immunitaire. Cependant l’activation incontrôlée du Complément peut être à l’origine de dommages tissulaires, comme lors de rejet de transplantation, de pathologies inflammatoires et, découvert très récemment, lors de certaines pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Nous avons montré que le fucoïdane bloque le complément en inhibant les deux voies d’activation classique et alterne du système du Complément. Ce processus dépend initialement de l’activation d’une protéine de reconnaissance C1q qui s’associe alors de manière non covalente avec deux enzymes C1r et C1s, pour constituer le complexe pentamérique C1( 850 kDa). Les premiers résultats obtenus montrent que les polysaccharides sulfatés et le fucoïdane en particulier interagissent avec C1q et interfèrent ainsi avec le processus d’activation du Complément. Des expériences à l’échelle de la molécule unique ont permis de montrer que le fucoïdane établit des interactions avec une région précise de C1q (la partie coudée du domaine collagène), ce qui empêche l’incorporation de la sous-unité enzymatique du complexe C1. Malgré la masse élevée de C1q, son analyse par spectrométrie de masse (MALDI-TOF, Electrospray) est possible et est très utile pour comprendre son interaction avec le polysaccharide. Enfin la protéine C4, entrant dans la formation de la C3 convertase, est une autre cible du polysaccharide : l’analyse par électrophorèse capillaire d’affinité a montré pour la première fois, la formation d’un complexe entre C4 et le fucoïdane.